不溶性微粒应用专题 | 疫苗中不溶性微粒测试探讨

本文隶属于复杂制剂应用专题，全文共 7638 字，阅读大约需要 20 分钟

摘要：不溶性微粒作为药品中不容忽视的颗粒杂质，其来源广泛，可能在药品生产、运输、储存及使用的多个环节混入。进入人体血液循环后，这些不溶性微粒可能会引发炎症、肉芽肿、血栓等严重健康问题，甚至可能与肿瘤发生有关。疫苗通常通过注射给药，其中的不溶性微粒会干扰免疫反应，进而影响疫苗的安全性和有效性。例如，疫苗辅料蔗糖中的不溶性微粒可能引发速发型过敏反应。各国药典对不溶性微粒检测规定存在差异。《中华人民共和国药典》（ChP 2025）目前主要针对静脉注射类制剂，而常见疫苗接种剂型未被覆盖。美国药典（USP-NF 2024）则将多数肠外给药产品（包括疫苗注射剂）纳入检测，并明确了不同容量规格注射液的微粒限值。日本药典和欧洲药典检测范围同样涵盖疫苗注射剂。本文列举了几种疫苗中不溶性微粒检测技术，其中光阻法凭借检测速度快、操作简便的优势成为主流，但其易受样品颜色、浊度和粘性干扰，且无法区分微粒的性质；显微镜法虽能直观观察微粒形态等特征，但操作繁琐、效率低且容易受到主观因素影响。新兴的纳米颗粒跟踪分析（NTA）、扫描电子显微镜技术（SEM）和微流数字成像（MDI）技术为检测提供了新途径，不过也存在样品制备复杂、对小于5μm的颗粒区分困难等局限。鉴于此，本文结合各国药典法规与技术方法的对比研究，就优化疫苗不溶性微粒检测体系提出探讨。建议在未来修订过程中，适时参考国际标准，逐步完善注射剂检测范围，使疫苗注射剂的质量监测更具针对性，以进一步提升疫苗的质量管理水平，助力公共卫生安全。

关键词：不溶性微粒；疫苗；药典法规；光阻法（LO）；显微计数法（MM）；微流数字成像（MDI）

不溶性微粒是指不溶于输液、肉眼不可见的非代谢性颗粒杂质，粒径通常小于50μm。其来源广泛，涉及药品生产、运输、储存及使用等多个环节。不溶性微粒对人体健康危害显著。进入人体血液循环系统后，可能引发多种不良后果，它能够刺激血管内皮细胞，引发炎症反应，导致静脉炎、动脉炎等病症，还可能诱导机体产生肉芽肿，肉芽肿可出现在肺脏、脾脏、脑、心脏等多个重要脏器，大量肉芽肿的形成会干扰脏器正常功能，严重时危及生命。不溶性微粒会破坏血管壁，促使血小板粘附，进而形成血栓，引发血管栓塞，导致组织坏死、肺损伤、脑梗塞等严重并发症。某些情况下，不溶性微粒还可能引发热原反应，出现高热、出汗、昏晕、呕吐等症状，严重者甚至休克。部分动物试验显示，不溶性微粒与肿瘤和癌症的发生存在关联^[1]。鉴于不溶性微粒的严重危害，对其进行检测十分必要，各国药典均将注射剂中的不溶性微粒检查列为必检项目，通过检测可有效评估药品质量，及时发现药品在生产、储存和运输过程中引入的不溶性微粒是否超标，从而保障患者用药安全，降低不良反应发生的风险。

疫苗是预防疾病的关键生物制品，疫苗通常通过注射方式进入人体，其中的不溶性微粒随之进入血液循环系统，有引发危害的风险，近年来，疫苗引发的不良反应受到社会关注^[2]。从免疫反应角度来看，有研究结果表明，疫苗用辅料蔗糖中的不溶性微粒可诱导Th2型免疫应答，导致IgE抗体水平升高和单核细胞趋化蛋白（MCP-1）表达增加，进而引发速发型过敏反应，如荨麻疹或过敏性休克。疫苗中的不溶性微粒极有可能干扰正常的免疫反应，不仅影响疫苗的预防效果，还可能引发不良反应，降低疫苗的安全性和有效性，建议完善疫苗注射剂不溶性微粒的检测方法和法规，加强辅料质量控制^[3]。

本文旨在分析疫苗中不溶性微粒的检测现状及其重要性。通过对比《中华人民共和国药典》（ChP 2025）、美国药典（USP-NF 2024）、欧洲药典（EP 11.0）及日本药典（JP 18）中关于不溶性微粒检测的规定，探讨各国药典注射剂检测范围规定的异同。此外，本文综述了光阻法、显微镜法、微流数字成像等检测技术的特点与应用潜力，提出中国药典中增设疫苗不溶性微粒检测标准的建议，以推动疫苗质量控制体系的完善，确保患者用药安全。

根据2020年版《中华人民共和国药典》通则<0903>^[4]，中国药典对不溶性微粒的检查范围是：静脉用注射剂（溶液型注射液、注射用无菌粉末、注射用浓溶液）及供静脉注射用无菌原料药中不溶性微粒的大小及数量。在2025年版《中华人民共和国药典》通则<0903>中，检测范围扩展到用于静脉注射、静脉滴注、鞘内注射、椎管内注射的溶液型注射液、注射用无菌粉末及注射用浓溶液，以及供注射用无菌原料药^[5]。

根据接种方式，疫苗主要可分为肌肉注射、皮下注射、皮内注射等几种常见方式^[6]。其中肌肉注射是常见的接种方式，乙肝疫苗、百白破疫苗、狂犬病疫苗等众多疫苗都采用这种方式接种。皮下注射适用的疫苗包括麻疹疫苗、风疹疫苗、腮腺炎疫苗等。皮内注射典型的例子是卡介苗。静脉注射这种方式是将疫苗直接注射到静脉中，能使疫苗迅速进入全身循环，但由于其直接进入血液，风险相对较高，在疫苗接种中并不常用。因此，现行中国药典的不溶性微粒检测范围尚未涵盖肌肉注射、皮下注射等常见疫苗接种方式。但鉴于不溶性微粒对人体健康的潜在危害，未来药典修订时应考虑将这些疫苗剂型纳入不溶性微粒检测体系为好。

根据美国药典USP-1^[7]和USP-NF <788>^[8]，除了4种可豁免剂型外（兽用产品、专门包装并标识为仅用作冲洗液的肠胃外制剂、放射性药物制剂、给药前需使用终端过滤器的肠外产品），其余通过肠外给药产品（包括疫苗注射剂）均需满足不溶性微粒检测的要求。

因此，疫苗中的不溶性微粒水平同样需满足USP788要求，大容量（＞100mL）注射液中，每 1mL 中≥10μm的微粒数需＜25粒，≥25μm的微粒数需＜3粒；小容量（≤100mL）中，每个供试品容器（份）中，≥10μm的微粒数需＜6000粒，≥25μm的微粒数需＜600粒。

欧洲药典并未强制要求疫苗中不溶性微粒检测。在肠外制剂专章里，虽对注射剂的不溶性微粒检测（包括亚可见和可见颗粒检测）作了规定^[9]，但免疫制剂类疫苗并未在其范围之内。在疫苗相关专章和中，也未提及不溶性微粒检测相关内容^[10]。

日本药典要求，除另有规定外，注射剂和制剂的载体需要符合JP<6.07>或JP<6.17>的要求^[11]。根据日本药典对注射剂的定义，注射剂是无菌制剂，通过皮肤、肌肉或血管直接注入体内，通常为活性物质(一种或多种)的溶液、悬液或乳剂形式，或含有活性物质(一种或多种)并在使用前溶解或悬浮的固体形式。因此，疫苗作为注射剂类产品，理应满足该药典规定的检定标准^[12]。

表1 不同药典中对不溶性微粒检测范围的规定

光阻法（Light Obscuration，LO）是目前各国药典检测不溶性微粒的主要方法之一，其原理是当液体中的微粒通过一窄小的检测区时，与液体流向垂直的入射光，因被微粒阻挡而减弱，由此产生的电信号变化经仪器处理后可测定微粒的大小和数量。该法优点是检测速度快、操作相对简便，能对大量样品进行快速检测，缺点是对于一些有颜色（如蓝色，因为光阻法的激光光源多为红光光源）会影响检测结果的准确性，且无法区分微粒的性质，对于粘性较大的样品需要稀释后进行测试（确保测试过程无抽空，无颗粒间的重叠）。

显微镜法（Microscopy Method，MM）是药典收录的不溶性微粒检测方法。通过将供试品过滤，在显微镜下观察并计数滤膜上的微粒，以此确定供试品中不溶性微粒的数量和大小，显微镜法的优点是可以直接观察微粒的形态、大小和数量，能直观地判断微粒的性质；缺点是检测过程较为繁琐、耗时，操作员每天在使用设备之前需要用NIST可溯源的千分尺对仪器进行调焦和校验，，且显微计数法不适用于高粘性产品、易在空气中变化的产品，易通过滤膜（如含硅油颗粒等特殊成分）的产品也不适用，这类产品微粒难以被有效截留，会导致检测结果失准，还不适用于尺寸过小、透明度极低、过厚、表面不平整、处于动态变化、有特殊环境要求以及的样品。

且该方法受操作人员的技术水平影响较大，不适用于大量样品的快速检测。如显微镜法专章 USP<1788.2>明确规定，操作人员对显微镜的熟练运用是确保膜显微镜法有效实施的关键，在培训过程中，操作人员需借助标准物质展开系统的实操训练。具体而言，操作者和培训人员要针对同一标准样本分别进行三次独立检测，且每次检测结果的相对标准偏差（RSD）必须控制在≤5%，不同操作者之间的RSD差异也应保持在≤10%。且显微镜法的准确性在很大程度上取决于操作者对粒子尺寸的主观判断。在实际操作中，当需要区分接近阈值（如9μm与10μm）的颗粒时，光学衍射效应、背景干扰以及操作人员的疲劳等因素，都极有可能引发显著误差，这意味着即使经过严格培训，操作人员在面对复杂样本时，仍可能因各种客观和主观因素影响，导致检测结果出现偏差。此外，对于高颗粒负载的样本（例如每膜含有≥3000个颗粒），若采用完整计数法，所需时间会超过1小时，检测效率较低^[13]。

综上所述，显微镜法鉴于其对操作人员专业素质的高要求、检测效率的限制，以及主观判读过程中难以避免的误差，面临着合规风险与成本压力。因此，光阻法因其高效、准确和自动化程度高，逐渐成为不溶性微粒检测的方法^[14]。各国药典光阻法、显微镜法也在逐步更新。如下汇总了中国药典及美国药典不溶性微粒检测方法的演变历史。表格如下：

表2  美国药典不溶性微粒检测方案历史演变

表3  中国药典不溶性微粒检测方案历史演变

通过中、美药典对于不溶性微粒检测方法的方法的演变史，可以看到，对于不溶性微粒的检测方法的理解在不断深入和优化。1985年版USP788更新，在原有显微镜法的基础上，增加了光阻法，随后将其列为一法，USP788中光阻法作为方法，适用于大多数常规注射剂，显微计数法作为二法，适用于特殊剂型，如乳剂、脂质体，或在光阻法不适用时作为补充方法。2000年中国药典CP0903中也新增了光阻法这一检测方法学^[15]。2004年，中山大学附属第三医院对4种输液样品分别进行了光阻法和显微镜法的对比研究，检测每毫升中直径≥10 μm和≥25 μm的微粒数。研究结果表明，光阻法与显微镜法的实验数据无显著性差异，而光阻法在智能化程度和操作简便性上优于显微镜法，逐步取代了传统的人工检测方法^[14]。次年（2005年），中国药典将光阻法列为一法，显微镜法列为第二法，与国际标淮接轨，一直沿用至今。

兰州生物制品研究所的一项研究中^[16]，为评价口服三价重配轮状病毒减毒活疫苗( Vero 细胞) 的运输稳定性，以兰州市至广西壮族自治区公路运输路线来模拟疫苗运输过程的最差条件，进行一次往返运输，用温度及温度循环等破坏性试验来模拟疫苗脱冷链后在条件下的情况，通过检测外观、pH、渗透压、装量、不溶性微粒、重金属、病毒滴度、异常毒性等项目来考察疫苗温度偏移稳定性。其中不溶性微粒项目，依据《中华人民共和国药典》2020 版（三部）物理检查法使用光阻法进行检测。

兰州生物制品研究所另一项研究中，同样使用了光阻法进行不溶性微粒检测^[17]，考察不同组合的内包装材料对 Hib 结合疫苗的影响。通过设计不同组合实验，选出适合的包装材料。实验过程中对所选药品包装材料按照生产厂家的不同来搭配，共得到 12 种组合，根据相容性试验设计，将样品置于 25 ± 2℃ 环境下，分别在1、2、3、6 个月时取样，进行pH值、内毒素、不溶性微粒3 个项目的检测，其中不溶性微粒项目参照药典标准，对微粒直径(≥10 μm) 和(≥25 μm) 数据进行分析。再对三种检测指标综合比较得出优组合，对 Hib 结合疫苗的影响最小。实验中的pH 值、内毒素含量和不溶性微粒这3个试验项目分别反映了该疫苗的化学、生物和物理3类指标，能客观地示不同组合的包装材对疫苗质量的潜在影响。

王珏等人的一项研究中，通过建立小鼠腘窝淋巴结模型，对疫苗用辅料蔗糖中不溶性微粒激发免疫应答风险进行了初步评估^[3]，该项研究从蔗糖样品中滤去蔗糖提取浓缩液，制得不溶性颗粒物样品，采用纳米颗粒跟踪分析仪测定粒径及其分布，采用全自动扫描电子显微镜观察其颗粒形态，微粒粒径为100～300 nm，不同厂家蔗糖的不溶性微粒在大小和数量上均存在差异，采用小鼠腘窝淋巴结模型对蔗糖中不溶性微粒激发免疫应答风险进行评估，结果表明蔗糖中不溶性微粒存在引发速发型过敏反应并诱导 Th2 免疫反应的风险，也能直接作用于脾淋巴细胞，提高其增殖能力，不同厂家的蔗糖产品显示出对小鼠脾淋巴细胞增殖不同程度的影响，作用程度与产品中不溶性微粒的数目有关。研究中采用的纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）技术，是一种基于光散射原理的单颗粒检测技术，激光照射使微粒散射光，相机捕捉散射光并跟踪微粒运动轨迹，利用斯托克斯-爱因斯坦方程计算粒径，不仅能测量粒径分布，还可得到颗粒浓度信息；而扫描电子显微镜技术（Scanning Electron Microscopy，SEM）是利用电子束扫描样品表面，激发出二次电子、背散射电子等信号，再将这些信号转化为图像，能观察到不溶性微粒的形态、大小、分布等特征。

Grant E. Frahm等人研究了微流数字成像（Microflow Digital Imaging，MDI）技术在含不透明疫苗佐剂的制剂中评估亚可见颗粒的能力^[18]，制备了一种混合溶液模拟含佐剂疫苗的实际情况，还对一种流感疫苗进行了检测，分别评估了不含佐剂以及含有50%过滤后AddaVax™（体积比）的流感疫苗中的亚可见颗粒。微流数字成像技术通过让颗粒在流动池中流动并进行数字成像来分析颗粒，能评估2 - 80μm的亚可见聚集体，对透明颗粒灵敏度高，还可区分颗粒亚群，但存在局限性，如高浓度佐剂会影响PS颗粒测量，对部分颗粒计数有偏差，且受仪器分辨率限制，无法区分小于5μm的颗粒类型。

疫苗作为预防疾病的核心生物制品，其安全性与有效性直接关乎公众健康。然而当前《中华人民共和国药典》（ChP 2025）对不溶性微粒的检测范围仍局限于静脉注射类制剂，未覆盖肌肉注射、皮下注射等主流疫苗接种方式。兰州生物制品研究所在围绕疫苗的不溶性微粒开展了较多的研究工作。其中，在对疫苗的运输稳定性进行评估时，参考ChP 2020<9402>《生物制品稳定性试验指导原则》^[19]，将不溶性微粒作为检验运输前后疫苗产品质量的重要指标，另外，在考察内包装材料对疫苗影响时，也将不溶性微粒作为一项重要指标，且参考标准都是ChP 2020<0903>不溶性微粒检测专章，说明虽然药典没有强制要求疫苗检测不溶性微粒，但在实际疫苗研发、生产与质量控制中，业内已开始重视不溶性微粒这一指标对疫苗质量的影响。另外，通过这些研究，发现围绕疫苗的不同环节（诸如运输、存储等）不溶性微粒指标差异大，且对最终产品的品质有着巨大的影响。因此，对疫苗中潜在的不溶性微粒风险的监控是很有意义和必要的。

因此，在未来的修订中，中国药典可考虑进一步拓展不溶性微粒检测的适用范围，将肌肉注射、皮下注射等疫苗纳入检测体系，并参考国际标准，如美国药典（USP-NF 2024），结合光阻法、显微计数法等技术，以优化疫苗不溶性微粒的检测方法。此外，加强对疫苗辅料中不溶性微粒的源头控制，也将有助于提升疫苗生产全流程的质量保障。也有助于提升疫苗生产的整体质量水平及质量稳定性。